Stefano Fresi comincia ad avvicinarsi al teatro attraverso la musica; è infatti un compositore, un cantante e un musicista e solo successivamente si cimenta anche nella recitazione. Con la sua performance nello spettacolo teatrale I tre moschettieri, di Attilio Corsini, cattura l’attenzione di Michele Placido che gli chiede di interpretare il Secco nel suo film drammatico Romanzo Criminale (2005).

Inizia così la sua inarrestabile carriera. Nel 2008 è diretto da Anna Negri in Riprendimi, nel 2012 da Massimiliano Bruno in Viva l’Italia e nel 2014 inizia la fortunata saga di Smetto quando voglio, di Sydney Sibilia, grazie alla quale ottiene la candidatura ai David di Donatello come miglior attore non protagonista. Nel 2016 riceve il Premio internazionale Vincenzo Crocitti come miglior attore cinematografico.

Nel 2014, tra gli altri, recita nel film Ogni maledetto Natale, nel 2015 in Noi e la Giulia di Edoardo Leo e in La prima volta (di mia figlia) di Riccardo Rossi con cui vince il premio come miglior attore alla XX edizione di Roseto Opera Prima. È del 2017 il film Cuori Puri che viene presentato al Quinzaine des Réalisateurs al Festival di Cannes. Nel 2018 è al fianco di Paola Cortellesi nel film campione d’incassi La befana vien di notte. Nel 2019 è protagonista del film C’è tempo, per la regia di Walter Veltroni, che, insieme a Ma cosa ci dice il cervello di Riccardo Milani e L’uomo che comprò la luna di Paolo Zucca, gli vale il Nastro d’Argento 2019 come miglior attore di commedia.

Non dimentica però il teatro, suo primo amore, tornando in scena dal 2018 con due spettacoli: Sogno di una notte di mezza estate per la regia di Massimiliano Bruno e DonChisci@tte di e con Alessandro Benvenuti.

Nel 2019 si cimenta con il doppiaggio di Pumpaa nella versione live-action americana de Il Re Leone, accanto a nomi come Marco Mengoni, Elisa ed Edoardo Leo.

Il 2020 lo rivede protagonista di molti progetti importanti, tra i quali il film Il Grande Passo, con Giuseppe Battiston, diretto da Antonio Padovan, presentato al Festival di Torino, Il Regno di Francesco Fanuele e Figli diretto da Giuseppe Bonito a fianco di Valerio Mastandrea e Paola Cortellesi.

Nel 2021 affianca Roberto Bolle alla conduzione del programma di Rai1 Danza con me ed è nel cast del film Lasciarsi Un Giorno A Roma di Edoardo Leo.

Nel 2022 è fra i protagonisti di numerosi film, tra i quali La Donna Per Me di Marco Martani, Ritorno al presente di Toni Fornari e Andrea Maia, Tutti a bordo di Luca Miniero, War di Gianni Zanasi e The Land Of Dreams diretto da Nicola Abbatangelo e presentato in anteprima come Evento Speciale ad Alice Nella Città – Sezione autonoma e parallela della Festa del Cinema di Roma.

Nel 2022-2023 torna a teatro con lo spettacolo Cetra una volta con la sorella Emanuela e Toni Fornari.

A inizio 2023 è di nuovo sul grande schermo al fianco di Claudia Gerini ne I migliori giorni, film corale diretto da Massimiliano Bruno ed Edoardo Leo ed è nel cast di Quando di Walter Veltroni.

A lui si deve la scrittura del jingle della Rai in onda dal 2010 e di Sky.